应用专题干燥失重法检测食品中微生物（单细胞酵母）的生长

  本项研究提供了一种基于干燥失重法的生物活性测试方法，为饮食业扩展了微生物检验测试范围的全新视角。

  20世纪以来，农业生产变得更工业化和机械化，食品的保存和防腐是长距离运送过程中最重要的工作。罐装、巴氏杀菌和真空密封等方法常被用来延长食品在运送过程中的保质期。但是实践证明，这一些方法是不完善的。在过去的一个多世纪里，许多消费的人都曾患过因食物变质而引发的疾病。食源性疾病是由微生物污染引起的，污染源包括大量的寄生虫、真菌、细菌甚至病毒。当任意一种微生物污染源被人类误食后，他们将在人体内迅速复制和繁殖，并引发疾病，严重的情况下甚至会导致死亡。

  今天，我们有更严格的政府监督和持续的微生物检测，以确保我们70亿消费者的食品安全。这些测试方法有：选择性培养、各种微观测试或光谱学测试、酶联分析和上市前的基因筛查等。然而，尽管我们有如此多的检测的新方法，食源性疾病仍然是一道公共卫生风险。关于鸡肉、生菠菜、宠物食品等食品的细菌污染和产品召回报告仍然能在我们的集体意识中引起共鸣，并促使食品制造业和政府机构寻求更好的方法来检测和预防微生物污染。

  除了病毒以外，大多数食源性微生物都有一个共同的生命进程：进食，生长或复制，产生废物。事实上，呼吸对于生物完成这一生命进程是必不可少的，尽管有一些微生物在缺氧（厌氧呼吸或发酵）的情况下也能完成。有氧呼吸描述的是在有氧条件下从复杂的有机分子（如糖、脂肪或蛋白质）中释放能量的过程。在这一过程中，二氧化碳和水蒸气作为副产物被释放开来，有机体会损失质量（或重量）。质量的损失不仅来源于水分的释放，更重要的是碳由固态转变为气态的二氧化碳所带来的损失。

  根据所有生命体在呼吸过程中都会经历质量损失的特性，理论上能够正常的使用质量损失的方法测量生物活性。由于大多数人类病原体的最佳生长温度为37℃（人体温度），因此能在此温度下培养受污染的食品样品，并测量质量损失率。我们大家可以使用标准培养方法来实现这一点，定期对样品进行称重，以跟踪质量损失率，并与对照样品（同样的样品，但没有污染）进行对比分析。为了验证这一假设，我们使用干燥失重水分分析仪（Computrac MAX 4000XL）和附加的湿度空气泵进行模拟测试。湿度空气泵可以使样品处于受控的湿度范围；MAX 4000XL能够保持样品的温度，在较长的时间内提供准确的重量损失读数，并且还可以测量气体流量（湿度空气）。大多数食源性病原体由细菌（如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肉毒梭菌等）组成，我们在此次AZI实验室选择了一种常见的面包酵母，酿酒酵母作为研究对象。这种酵母是一种生长速率相对较快的单细胞酵母（繁殖时间为90min），通常作为面包和糕点的发酵剂。它在性质上是无害的，不是人类病原体，但与某些致病酵母（如白色念珠菌）具有相似的生理学特性。

  在本研究中，我们首先使用离体测试方法，通过测量接种酵母的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的失重数据来验证该方法的可行性，然后使用类似的方法对真实的食品进行分析测试。

  该项研究提供了一种基于干燥失重法的生物活性测试方法，为食品行业扩展了微生物检测范围的全新视角。这种方法并非要取代任何一种传统的检测方法，而是希望在食品安全的质量检验过程中增加一种新的检测方法。由于本研究中专门研究了酿酒酵母的发酵特性，因此这种方法在确定某些酵母在面包或酿酒行业的可行性方面特别有用。传统的光谱法只能通过光密度表征酵母的种群密度，不能进一步说明他们的碳排放能力。

  马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）是一种半固体培养基，通常用于实验室真菌培养。琼脂是一种海藻提取物，具有与凝胶相似的硬度，由纤维素取代蛋白质组成（明胶）。由于琼脂不含蛋白质，因此可以在121℃下进行消毒，并且仍然保持凝结性能，而不像明胶在这个温度下会变性。需要重点注意的是，当微生物在琼脂上生长时，琼脂本身不会被消耗掉，它只是一个支架，用来保留与之混合的液体营养液（本研究中指的是PDB）。

  马铃薯葡萄糖培养液是将去皮的马铃薯炖煮，并以正确的比例添加葡萄糖，制备的一种可以被真菌使用的营养液。单细胞酵母可以在这种液体培养基中以点细胞悬浮液生长，这种培养方式被称为液体培养。

  在本实验中，我们选用直径为5英寸的平底样品盘作为培养皿（或聚苯乙烯培养皿），在121℃下消毒30min后待用。从烘箱中取出熔化的PDA混合物，将其放置在500ml的锥形烧瓶中冷却至约50℃，烧瓶瓶口轻微打开。在无菌工作台内，移取30ml冷却的PDA培养基，倒入无菌的空白培养皿中，然后用热消毒锅的铝制样品盘（4000 XL样品盘）覆盖每个培养皿，以防止污染。待PDA凝固后，使用密封条将盖子和培养皿密封，防止水分过度流失，并将其存放在4℃的冰箱中。

  移取部分PDB用于培养酿酒酵母（7g/包）。将100ml PDB和约3.5克冻干酵母添加到经热灭菌的500ml烧杯中，并在无菌条件下搅拌混匀。在2小时内，每隔30min周期性地搅拌混合液，然后将其存储在4℃冰箱中，以备后续使用。

  液体培养基中的酵母经过大量繁殖，即可接种至PDA培养基上。将一个经火焰灼烧消毒的接种环浸入至液体培养基中，以粘附酵母细胞，然后均匀地涂布，是酵母分散在培养基表面。每个培养皿涂布三次，以提供足够数量的酵母初始种群。将所有接种过的培养皿倒置，以防止盖子上的冷凝水滴落至平板上并干扰细胞生长，具体操作方法如下图所示：

  本实验使用的是小麦面包，面包片存储在4℃的冰箱中。在实验开始前一个小时取出面包片，使其温度达到室温。将对照组的放置在样品盘上，使用无菌移液器在其表面滴加5滴无菌PDB液体培养基，其中4滴分别分布在面包片的四个角落，剩余1滴在面包片中心。对实验组的面包片执行同样的操作，与对照组不同的是，我们滴加的是含有酵母细胞液体培养基。培养基的添加方式如下图：

  为了实时跟踪重量损失情况，我们需要将测试时长为2小时的单个测试程序串联12次，以提供准确并持续的24小时内重量损失的数据。使用仪器的“WebServer”功能，将仪器与实验室局域网联通，可以帮助测试人员以EXCEL格式将原始数据导出并进行分析。若仪器启用“Web Server”功能，当关机后重新开启仪器时，需要重新连接局域网并建立新的IP地址。通过“菜单”→“设置菜单”→“以太网设置”即可查看仪器的IP地址。

  酿酒酵母并不是线℃对酵母的最佳生长条件来说温度太高，因此我们将温度下调至30℃。需要主要的是，仪器屏幕上能够显示稳定的温度读数，但是在使用前需要通过外接热电偶温度探针进行校验，以确保温度的准确性。MAX 4000XL在实验过程中的作用类似于一个培养箱：为酵母生长提供最佳温度条件，同时在一定时间内实时测量重量损失的情况。每个单独的2小时的测试程序设置参数如下：

  由于每个测试程序的输出结果默认为“水分百分含量”，因此我们创建了一个自定义公式来定义总重量损失百分比。前两个小时的测试程序不需要这个公式，但是接下来的测试程序则需要用到这个公式，以实时准确的提供重量损失数据。

  大多数食品中都含有大量的水分，根据样品大小、水分分布情况、样品表面状况以及所处环境不同，具有各自独特的蒸发曲线。为了最大限度地减少琼脂培养基和面包片的水分蒸发，我们将空气发生器（DAG）改造成加湿器，如下图所示。DAG产生的气流经导管进入500ml密闭锥形瓶中，在蒸馏水中鼓泡，形成潮湿气流，然后经过管路进入MAX 4000XL的测量室。未连接DAG时，仪器测量室的RH读数为10.6%，连接DAG，潮湿气流进入仪器测量室30min后，RH读数增加至26.5-30.1%，此时测试温度为30℃。

  最初，MAX 4000XL设计的氮气吹扫功能，可以使高挥发性和潜在爆炸性的样品在无氧室内进行测试（防止燃烧或爆炸）。对于这个实验，仪器的这个功能可以为样品和在其上生长的酵母提供半潮湿的环境。

  当选择12个串联测试中第一个测试程序且温度达到30℃时，所有的测试程序就绪并依次运行。点击开始，仪器依次提示称量样品盘，在规定的称样范围内称量样品（10-40g）。对于PDA样品（对照样品和接种样品），测试时应去除培养皿上的盖子，然后将其向上放置在仪器的样品盘上面，仪器会识别重量的变化以及是否在可接受范围内。然后提示关闭保护盖，此时测试程序开始运行并持续24小时。

  MAX 4000XL会自动存储测试数据，也可以通过Web Sever功能将原始数据以EXCEL格式导出。必须通过剪切和粘贴的方式将原始数据转移至新的表格中并重新排序，因为导出的报告的数据顺序与测试顺序相反。建立测试方法时自定义的公式只能在仪器屏幕上显示，数据导出后必须在EXCEL表格中重新建立公式进行重量损失百分比的计算。公式如下：

  MAX 4000XL每30秒读取一次样品重量和损失速率。但是，当一个新的测试开始时，仪器不能立即识别到这是一个链接测试，此时重量损失百分比和速率都会下降至零点。如果将前30秒的数据保留在结果序列中，则在生产的图表中每隔2小时每个测试程序开始时会出现数据急剧下降，并影响平均值的计算，因此可以将这段数据忽略掉。

  在EXCEL表格中使用标准散点图创建本文结果部分所示的图表，纵坐标为3次重复试验的“总重量损失百分比”平均值，横坐标为测试时间（单位为小时）。实验过程中的4个变量分别为：

  本研究的第一个难点是，必须用数据验证通过重量损失来衡量生物活性的理论的可行性。从一开始我们就知道，将任何样品放置在MAX 4000XL的测量室内，仅靠水分蒸发就会导致重量损失。因此，我们需要得到一个富含营养的PDA培养基的基准蒸发曲线。下图所示的蓝色曲线即为未接种酵母的PDA培养基的重量损失曲线，测试数据来源于三次独立的重复实验。

  确定了基准蒸发曲线（更准确地说是总失重百分比曲线）后，我们就可以预测，如果一个生命有机体（酿酒酵母）开始在培养基中消耗葡萄糖，便会产生二氧化碳和水分，琼脂培养基会比对照组的样品以更快的速率损失重量。尽管我们不能完全证明二氧化碳和水分是造成重量损失的元凶，但我们仍然可以观察到，测试时间达到8小时后，实验组样品的重量损失比例比对照组更高。随着时间的延长，实验组的重量损失百分比更高。24小时的测试程序结束后，对照组样品的重量减少约6.88%；而接种酵母的实验组样品的测试数据为11.21%，差距为4.33%。两组实验均独立重复测试3次，数据记录间隔为2小时。

  当确认理想条件下重量损失可以衡量生物活性之后，我们将注意力转向一种简单但实用的食品：面包。面包制作过程中会使用酵母发酵，本身含有酵母容易吸收和利用的营养物质。

  如前所述，每种食物类型都有不同的水分释放特性，因为我们必须首先确定面包的基准水分释放曲线，然后与因生物活性而导致的重量损失进行比较。由于面包的含水量高，且比琼脂板表面积大，实验证明面包的水分蒸发率比琼脂板大得多，但是最终会到达一个平台期。

  在PDA的实验中，接种酵母培养液不会带来大量的水分。但是，在面包片实验中，考虑到面包表面粗糙性，无法使用接种环进行涂布接种。为了在面包上添加更多的酵母，我们直接在面包片上滴加5滴含有酵母的PDB液体培养液（保证酵母开始生长时有足够的水分）。这5滴培养液给面包片带来了大量的水分，因此，我们在对照组样品上也滴加了5滴无菌液体培养液（不含酵母）。在24小时的培养时间内，对照组的重量损失率为26.76%；实验组的重量损失为28.39%，二者相差1.63%。

  与PDA实验相比，实验组和对照组的差异更小，但考虑到仅仅水分蒸发就损失了非常多的质量，在培养至第14小时后，我们能够观察到两组样品存在统计学上的差异。面包片的测试方法与PDA测试方法完全相同。

  基于孵育的食品微生物污染检测并不是食品安全筛选的新技术。事实上，选择性培养和光谱学方法往往依赖于增加潜在污染形式的物理数量，以便光谱学方法可见的感知或检测范围。重量损失法作为一种新的方法可以指示食品中微生物的存在，但是首先要了解每种产品的水分释放基准曲线。使用这种方法，实验人员无需使用昂贵的选择性介质或专门的光密度容器，将食品直接放置在MAX 4000XL的测量室内，无需任何加工或培养技术。此外，用户还可以实时查看水分释放速率（或重量损失速率）。值得注意的是，我们根据酿酒酵母的繁殖特点（倍增周期为90min），选择了24小时的培养周期（温度为30℃）。如前所述，酿酒酵母不是一种人类病原体，其性质类似于细菌。大肠杆菌是一种常见的食源性细菌，在理想条件下（37℃），大肠杆菌的倍增周期仅为20min。如怀疑受该细菌感染，分析人员可以选择一个相对较短的培养时间，但是通过一些前期工作来确定合适的培养时间。

  尽管DAG被改造成加湿器使用，但仍需进一步的研究以确定该装置能否对生长中的生物体施加足够的水分，但是该装置可以作为预防措施，以防止在测试过程中过度干燥。同时，我们也能够正常的使用该装置填充生长腔提供其他气体。在本研究中，个人会使用的是潮湿的空气。另外，我们也通过施加潮湿氮气来观察厌氧条件下重量损失的情况。经过数次试验，我们发现：厌氧条件下，接种酵母的PDA培养基的重量变化与有氧条件下未表现统计学差异。这可能与我们选择的酵母菌株有关，其在有氧和厌氧条件下均表现良好的适应性。有趣的是，在厌氧试验结束后，分析人员闻到了轻微的酒精气味。虽然纯属猜测，但可能表明酵母在这一过程中经历了发酵，释放了二氧化碳和酒精（而非水分）。

  本研究的数据对烘焙和酿造行业具有特殊的指导作用。除了细胞计数以外，也可以通过其他方法来测试酵母种群的生存能力，因为种群的数量或密度不一定表示培养物的生存能力强大。根据不同产品的重量损失百分比来确定酵母菌株的生长速率，可能有助于面包师或酿酒师对其产品最佳菌株的选择。

  也许MAX 4000XL的单培养腔可能存在一定的缺点，但是从微生物生长过程中收集的数据来看，我们能很好地了解其与食品间的相互作用。另外，一个稳定且受控的实验环境意味着测试开始后，无需打开盖子，这样就可以有效防止温度和湿度的波动。我们甚至可以在测试结束后链接一个灭菌程序。MAX 4000XL可以设置高达275℃的测试温度，但灭菌程序的温度设置为121℃就足以对大多数的食品做消毒。总的来说，Computrac MAX 4000XL用于检测微生物基于呼吸作用的生长情况是非常实用的，为分析人员提供了一种检测食品中潜在污染物的新的分析方法，帮助我们更好地了解固体和半固体食品中微生物生长和繁殖的实时情况。